中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准

出口蜂产品中四环素族残留量
检 验 方 法 SN 0205-93
Method for determination of the residues of
tetrracyclines in honey products for export
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1 主题内容与适用范围

本标准规定了出口蜂产品中四环素族残留量的抽样、制样和微生物检验的方法。
本标准适用于出口蜂王浆和蜂蜜中四环素族残留量的检验。

2 抽样和制样

2.1 检验批
蜂王浆以每一生产缸(约300kg)为一检验批。
蜂蜜以不超过1000件为一检验批。
同一检验批的样品,应具有相同的特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
2.2 抽样数量
对蜂王浆,每一生产缸取一份样。对蜂蜜,不超过50件包装取5件；51～100件,取10
件;101～500件,每增加100件,增取5件；501件及以上,每增加100件,增取2件。每件抽取
样品不少于100g,
作为原始样品。
2.3 抽样工具
2.3.1 取样器：不锈钢匙。不锈钢管,长约115cm、直径约2.5cm,或带活塞玻璃管。
2.3.2 混样器：搪瓷桶或杯。
2.3.3 单套杆：不锈钢制。
2.3.4 样品瓶：100mL、500mL磨砂盖广口玻璃瓶。
2.4 抽样方法
蜂王浆：按每缸的上、中、下三个部位抽样,样品混匀后,装入样品瓶内,标明标
记并及时送实验室冰箱中保存。
蜂蜜：按2.2的抽样件数随机抽取,逐件开启。将玻璃取样管缓缓放入,吸取样品。
如遇蜂蜜结晶时,则用单套杆或不锈钢取样管插到底,抽取样品。将所取样品倾入混样
器,混和均匀,装入清洁的样品瓶内,加封后,标明标记,及时送实验室。
2.5 试样制备
蜂王浆样品从冰箱中取出后,在室温下融化,搅拌均匀。
蜂蜜中未结晶的样品将其用力搅拌均匀,对有结晶析出的样品可将样品瓶盖塞紧后,
置于不超过40℃的水浴中温热,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温,在融化时必
须注意防止水分挥发。
上述蜂王浆及蜂蜜试样均分成两份,装入洁净容器内,密封,并标明标记。
2.6 试样保存
蜂王浆：将试样于－1８℃冷冻保存。
蜂蜜：将试样于室温保存。
注：在抽样和制样的操作过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3 测定方法

3.1 方法提要
蜂王浆样品溶解于三氯乙酸或柠檬酸后,经离心去除样品中的蛋白质,然后用乙醚
除去蜂王浆中的癸烯酸等天然抗生物质。通过色谱柱内的树脂吸附和解脱,用微生物牛
律杯法进行鉴别试验,与标准比较进行定量。
蜂蜜样品经溶解后,直接通过色谱柱内的树脂吸附和解脱,以下检验的操作与蜂王
浆相同。
3.2 试剂和材料
除了特殊规定外,试剂均为分析纯；水为蒸馏水或相应的去离子水,溶液指水溶液。
3.2.1 乙醚、甲醇、三氯甲烷以及正己烷。
3.2.2 甲醇溶液：60%(V/V)。
3.2.3 柠檬酸缓冲溶液：pH4.0。
3.2.4 三氯乙酸溶液：2%(V/V)。
3.2.5 柠檬酸溶液：2%(V/V)。
3.2.6 氯化铵－磷酸溶液：称取1.0g氯化铵,吸取2mL85%磷酸液,量取160mL蒸馏水配
制而成。
3.2.7 氢氧化钠溶液：40%(m/m) 。
3.2.8 磷酸盐缓冲溶液：0.1mol/L。pH4.5,pH8.0。 
准确称取13.6g磷酸二氢钾置于950mL水中溶解,用氢氧化钾或磷酸二氢钾调节至pH
4.5和pH8.0,然后加水至1000mL。
3.2.9 生理盐水：0.85%的氯化钠溶液。
3.2.10 吸附树脂XAD-2(Amberlite,苯酚甲醛离子交换树脂)。
处理方法：用甲醇浸泡30min以上,然后用水以倾析法洗涤5～6次,浸泡于水中备用。
3.2.11 抗生素标准品：四环素(TC),土霉素(OTC),金霉素(CTC)。由国家卫生部药品生
物制品检定所规定之标准品。
3.2.12 抗生素标准贮备液及工作溶液
3.2.12.1 抗生素标准贮备液：准确地分别称取0.0500g(精确至0.0001g)抗生素TC,OTC
和CTC(其效价为1000单位/mg),各用 0.01mol/L 盐酸溶液溶解后并定容至50mL。抗生
素标准溶液为1000μg/mL。配置后在冰箱中保存,在一周内使用。如抗生素标准品的效
价低于1000单位/mg(1单位＝1μg ),配制时,则换算为1000单位/mg。
3.2.12.2 抗生素标准工作液：在工作时,吸取抗生素标准贮备液,用 pH4.5磷酸盐缓冲
液稀释配制成0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.0和2.0μg/mL的抗生素标准工作液。
3.2.13 色谱用的展开剂
正丁醇＋乙醇＋水＝4＋1＋5 
或 正丁醇＋甲醇＋水＝4＋1＋2
3.2.14 培养基及菌种制备
3.2.14.1 菌种用培养基
a. 胰蛋白胨 10.0g；
b. 牛肉膏 5.0g；
c. 氯化钠 2.5g；
d. 琼脂 14.0～16.0g；
e.蒸馏水 1000mL。
制备时,将上述a～d各组成分加入e中,搅拌加热至溶解。于121℃,高压灭菌15min,
最终pH为6.5±0.1。
3.2.14.2 检定用培养基
a. 胰蛋白胨6.0g；
b. 牛肉膏 1.5g；
c. 酵母膏 3.0g；
d. 琼脂 14.0～16.0g；
e. 蒸馏水 1000mL。
制备时,将上述a～d各组成分加入e中,搅拌加热至溶解,经121℃高压灭菌15min,
最终pH为5.8±0.1。
3.2.14.3 试验菌种：蜡样芽孢杆菌(Bacillus Cereus Varmycoides),菌种号63301,由
国家卫生部药品生物制品检定所规定的菌种。
3.2.14.4 菌种培养
将菌种安瓿瓶管的上部敲碎后,加入少量肉汤培养基,使其溶解并移至肉汤管中混匀。
置于30±1℃培养24h。取菌种单个菌落接种于菌种培养基中。采用试管斜面或克氏瓶内
培养,置于30±1℃培养1周。镜检芽孢菌数达到85%以上,便可制备芽孢悬浮液。
3.2.14.5 芽孢悬浮液制备
用适量灭菌的生理盐水洗下菌苔,于65℃恒温水浴中加热30min,再以2000r/min离心
20min,弃去上清液,重复2～3次。最终用适量的灭菌生理盐水稀释,即为芽孢悬浮液,
置于冰箱中保存使用。有效期为一个月。
3.2.14.6 平板制备
于灭菌后冷却至50～55℃的检定培养基中加入适量的菌液(如孢子悬浮液中的菌数
在10**7个/ml时,则按约0.1%量加入;如果10**6个/mL时,则按约0.5%加人,使0,05μg/mL
的TC标准液抑菌圈直径达到12mm)。混习后,立即注入平板。每个平板直接注入检定用培
养基6.0mL,凝固后备用。
3.3 仪器和设备
3.3.1 培养皿：内径90mm,底部平整光滑的玻璃皿,或塑料皿上用陶瓦盖。
3.3.2 牛津杯：外径8±0.1mm,内径6±0.1mm,高10±0.1mm的不锈钢杯,重量误差不超
过±0.05g。
3.3.3 游标卡尺：测量范围,0～150mm,精度为0.1mm。
3.3.4 长方形培养皿：1.5cm×8cm×23cm。
3.3.5 色谱柱：内径1cm,长30cm,具有活塞调节流速。
层析柱的制备：先用少许玻璃棉置于柱的底部,然后加入经处理的XAD-2树脂15mL,
树脂上端加入少许玻璃棉,并用300mL水,以150mL/h流速洗柱后备用。
3.3.6 色谱缸：20cm×15cm×30cm。
3.3.7 微量注射器：10μL或50μL。
3.3.8 半对数方格纸。
3.39 离心机,转速范围0～4000r/min。
3.3.10 旋转式真空浓缩器。
3.3.11 恒温培养箱：30±1℃,隔层置玻璃板并调节水平位置。
3.3.12 恒温水浴锅。
3.3.13 高压灭菌器。
3.3.14 水平台,带水平器。
3.3.15 色谱纸：6cm×20cm过滤纸。
3.3.16 分液漏斗。
3.3.17 氮气：纯度≥ 99.99%。
3.3.18 其他玻璃器皿。
3.4 测定步骤
3.4.1 样液提取
3.4.1.1 蜂王浆样液提取
准确称取5.0g(精确至0.1g)蜂王浆于小烧杯中,用80mL2%三氯乙酸溶液分数次溶解。
定量地移入离心管中,以2000r/min离心10min。将上清液移入250mL分液漏斗中。下层沉
淀物再分别加入40、20mL2%三氯乙酸溶液搅匀后离心,合并上清液于分液漏斗中。上述
上清液分别用60、60和30mL乙醚振摇,提去癸烯酸,弃去上层乙醚,将下层水溶液收集于
烧杯中,用40%氢氧化钠溶液调节pH至4.5,并加入pH4.5磷酸盐缓冲溶液60mL,备用。
或准确称取蜂王浆5.0g(精确至0.1g)于小烧杯中,加入100mL2%柠檬酸溶液,摇匀后,
加入100mL三氯甲烷,振摇后移入离心管中,并以2000r/min离心10min。弃去下层三氯甲
烷,加入100mL乙醚,充分振摇,离心后弃去上层乙醚层。再加100mL乙醚重复一次。于留
下水相中加入20mL氯化铵－磷酸溶液,用40%氢氧化钠溶液调节pH至5.0,再加入100mL正
已烷,振摇后离心。去除正已烷层,用氮气流吹除样液中有机试剂。
将经上述步骤中任一种提取的试样溶液,移入装有XAD-2树脂的层析柱中,并以100mL
/h的流速过柱,使样液中的四环素族被吸附。四环素族被树脂吸附后,用200mL蒸馏水洗
柱,流速控制为150mL/h。继用90mL60%甲醇洗脱四环素族,其流速为90mL/h,并用甲醇定
容至100mL备用。
3.4.1.2 蜂蜜样液提取
准确称取约50g(精确至0.1g)蜂蜜于300mL烧杯中,加入200mLpH4.0柠檬酸缓冲溶液,
搅拌均匀,使试样充分溶解后,用2%柠檬酸溶液或40%氢氧化钠溶液调节溶液pH至4.5,并
加入60mLpH4.5磷酸盐缓冲溶液。然后移入装有XAD-2树脂的色谱柱中,以100mL/h流速过
柱,使样液中的四环素族被吸附。以下操作步骤与上述蜂王浆的步骤相同。收集甲醇淋
洗液于100mL容量瓶中,并用60%甲醇定容至刻度,备用。
3.4.2 定量试验
3.4.2.1 标准曲线绘制
取5个试验用的平板,每个平板上放5个牛津杯,分别注满0.05、0.10、0.20、0.40、
和0.80μg/mL的TC标准工作液,并于30±1℃培养20±1h。然后测量各浓度的TC的抑菌圈
直径,求得各自的平均值,并经回归方程校正后,在半对数纸上,以抑菌圈直径为纵坐标,
TC浓度为横坐标,绘制标准曲线。每次试验时都需制备相应的TC、OTC或CTC标准曲线。
3.4.2.2 样液的定量试验
准确吸取50mL蜂王浆的甲醇提取液于梨形瓶中；而蜂蜜仅取10mL的甲醇提取液。在
40℃减压浓缩至干后,准确加入5.0mL pH4.5磷酸盐缓冲液,使浓缩物被溶解。此样液中,
相当于蜂王浆试样浓度为0.5g/mL,相当于蜂蜜试样浓度1.0g/mL。
取5个试验平板,每个平板放4个牛津杯。每板分别注满一个0.05μg/mL和一个0.10
μg/mL的TC标准工作液及二个蜂王浆试样提取液或二个蜂蜜试样提取液。置于30±1℃培
养箱培养20±1h后,测量抑菌圈直径,分别求得它们的平均值。经校正后,检液的抑菌圈
大于12mm时,应进行鉴别试验并按标准曲线计算出检液中的TC含量。如果检液的抑菌圈小
于0.05μg/mL的TC标准液的抑菌圈时,则可报告为“未检出抗生素”。试验不用进行下去。
3.4.3 鉴别试验
3.4.3.1 加热分解反应试验
取50mL蜂王浆的甲醇提取液,而对蜂蜜则取10mL的甲醇提取液,置于梨形瓶中,于
40℃减压浓缩至干。加入5.0mL pH8.0磷酸盐缓冲溶液,备作加热分解反应。取2支刻度
试管,每管加入2.5mL上述溶液,其中1支置于沸水浴中,加热30min,然后用1mol/L盐酸溶
液调节2支试管内检液至pH4.5,再用pH4.5磷酸盐缓冲溶液分别定容至5.0mL。同时于2
支刻度试管中分别吸取2.5mL0.2μg/mL的TC标准工作液(用pH8.0磷酸盐缓冲溶液配制
成),按试样提取液同样操作,最终定容至5.0mL。
取2个平板,各放4个牛津杯,每个杯中分别注入加热检液、未加热检液、加热后的TC
标准工作液和未加热的TC标准工作液。然后将平板置于30±1℃培养20±1h,观察和测量
各抑菌圈直径。
在未加热的0.1μg/mL TC标准工作液呈现出正常的抑菌圈,而加热的0.1μg/mL TC标
准工作液不出现抑菌圈的条件下,说明人工合成的抗生素在加热中被分解破坏。因此,未
加热检液的抑菌圈直径在12mm以上,而加热检液的抑菌圈直径在10mm以下,可初步推定检
液中含有TC族抗生素,并需作定性试验。
3.4.3.2 定性试验
本法采用微生物色谱法进行定性试验。用pH4.5磷酸盐缓冲溶液喷涂于色谱用纸(7cm
×22cm)上,自然干燥后备用。
定性试验的检液的制备,如是蜂王浆试样,准确称取5.0g试样后按3.4.1.1中样液提
取的操作步骤进行,收集100mL甲醇提取液于40℃减压浓缩至干,用0.1mL甲醇溶解。如是
蜂蜜试样,按3.4.1.2样液的提取操作步骤进行,所收集的100mL甲醇提取液中,吸取20mL,
置于40℃减压浓缩至干,用0.1mL甲醇溶解。
取TC和OTC标准工作液的浓度为2.0μg/mL,CTC的标准工作液的浓度为1.0μg/mL,
以及定性用的试样提取液各10～20μL,分别用微量注射器吸取并点在上述备用滤纸上。
将滤纸移放在盛有展开液的色谱缸中,展开3～5h后,取出。待溶剂挥发后,将滤纸轻轻
贴在事先加有60mL含有菌液的检定用培养基的长方形培养皿中,移至4℃的冰箱中放置
1h。取出培养皿,弃去滤纸,将培养皿置于30±1℃进行培养2±1h。根据培养皿中培养
基上出现的抑菌圈的位置,测得各抗生素的Rf值。对照标准,以确定被检试样中所含TC
族抗生素的种类。
3.4.4 结果计算和表述
3.4.4.1 检液的抑菌圈平均直径小于0.05μg/mL的TC标准工作液抑菌圈平均直径的,
可以结束试验,出具结果为“未检出抗生素”。
3.4.4.2 如在定量试验中,检液抑菌圈的平均直径大于12mm、加热反应试验确定为阳
性、定性试验确定是TC或OTC或CTC时,按下式计算蜂王浆或蜂蜜样品中抗生素含量：
c
X=──
m
式中：X??蜂王浆或蜂蜜试样中TC或OTC或CTC的含量,mg/kg；
c??从标准曲线上计算出检液相当于标准抗生素TC或OTC或CTC的浓度,μg/mL；
m??最终试液所代表的蜂王浆或蜂蜜试样的浓度,g/mL。
4 测定低限、回收率

4.1 测定低限
本方法的测定低限为0.05mg/kg。
4.2 回收率
回收率的实验数据：四环素族的浓度在0.05～0.20mg/kg范围,回收率为85.0%～93.4%。

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附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国上海、北京进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人黄伟坤、王培梁、王宝根、李慧珠、黎福膺、陈广全、刘玉萍。
主要参考文献：
日本厚生省食品卫生指定检查机关协议会：蜂蜜中のオキシテトラサンクリン(OTC)クロ
ルテトラサンクリン(CTC)及びテトラサンクリン(TC)试验法,昭和62年1月。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-06-04批准 1993-08-01实施