中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准

出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌 SN 0177-92
检　验　方　法　　　 代替ZB X09 004-86
Method for detection of clostridium perfringens
in food for export
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1　主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2　设备和材料
2.1　吸管1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度。
2.2　菌落计数器。
2.3　均质器。
2.4　厌氧培养装置。
2.5　超低温冰箱。
2.6　恒温培养箱：36±1℃。
2.7　恒温水浴箱：46±1℃。
2.8　培养皿：90或100mm。
2.9　显微镜。
3　培养基和试剂
3.1　胰(月示)-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂。
3.2 D-环丝氨酸溶液。
3.3　卵黄乳液。
3.4　缓冲动力-硝酸盐培养基。
3.5　乳糖-明胶培养基。
3.6　产芽孢肉汤。
3.7　多价蛋白胨-酵母膏(PY)培养基。
3.8　硫乙醇酸盐液体培养基。
3.9　蛋白胨水。
3.10 亚硝酸盐试剂。
3.11 缓冲甘油-氯化钠溶液。
4　样品制备
4.1 样品的贮存和运送
如不能立即进行检验时，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体食品应加双料
的)。将样品作低温保存，直到检验。运送样品时，应使样品保持冷冻状态，并要避免容
器破损。
4.2　制样
将样品解冻，取25g移入灭菌均质杯，加225mL蛋白胨水，以13000r/min均质2min，如
为液体样品，则取样25mL，加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，摇匀，吸取此1:10样
品匀液10 mL加于90mL蛋白胨水中，摇匀，制成1:100样品稀释液，必要时，按此法将样品
作进一步的10倍递增稀释，如从10**-3～10**-4……。
5　检验
5.1　平板计数法
倾注不含卵黄的TSC琼脂到10个灭菌平皿中，每皿约5mL，并迅速旋转平皿，使琼脂铺
平。当琼脂凝固后，将每个平皿编号标记，以无菌操作，吸取稀释液样品1 mL分别加到每
个琼脂平板表面中心。再向平皿中倾注不含卵黄的TSC琼脂15 mL，缓慢地旋转平皿，使其
与接种物混合均匀。
也可用灭菌L 形玻璃棒，将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于含卵黄乳液的TSC琼脂上，
将平行板水平静置5～10min，使接种物被吸收。然后用不含卵黄的TSC琼脂10 mL覆盖平板
表层(含卵黄的TSC琼脂最适于同时含有其他还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的食品)。琼脂凝
固后，将平板正置于厌氧罐内，于36±1℃培养。不含卵黄的TSC琼脂平板培养20 h，含卵
黄的TSC琼脂平板培养24h，取出平板，用肉眼观察生长情况和有无黑色菌落。挑选生长有
20～200个黑色菌落的平板，用菌落计数器将黑色菌落计数并计算每克食品中产气荚膜梭
状芽孢杆菌数。产气荚膜梭菌的菌落在含卵黄的培养基上呈黑色, 并通常有2～4mm宽的白
色沉淀环(卵磷脂酶作用的结果)。但有少数菌株的卵磷脂酶反应较弱，或呈阴性。应对所
有怀疑为产气荚膜梭菌的黑色菌落数进行计数，并按5.2条加以证实。
5.2　证实
从可计数的平板(具20～200个菌落)中挑选10个典型菌落，分别接种到液体硫乙醇酸
盐培养基试管中，36±1℃培养18～24h。取培养物涂片，作革兰氏染色，镜检，检查培养
物的纯度和细菌形态。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性，粗短的梭状芽孢杆菌。对于被污染的
培养物可划线接种在含有卵黄的TSC琼脂平板上，于厌氧条件下36±1℃培养24 h，以获得
纯培养物。
用3mm接种环，取液体硫乙醇酸钠纯培养物，或从TSC琼脂平板上分离到的单个菌落，
穿刺接种缓冲动力-硝酸盐和乳糖-明胶培养基。以1 mL液体硫乙醇酸盐培养物接种到产芽
孢肉汤中，36±1℃培养24 h。在透射光下检查缓冲动力-硝酸盐培养基试管中细菌沿穿刺
线生长情况,有动力的菌株沿着穿刺线呈扩散生长。没有动力的菌株,仅沿着穿刺线生长。
加0.5mL试剂甲和0.2 mL试剂乙于缓冲动力-硝酸盐培养基中以检查亚硝酸盐的存在。
于15min内出现橙色者，表明有亚硝酸盐存在。如果不出现颜色变化，则加少许金属锌粉,
放置10 min。如果加锌粉后，不出现颜色变化，表明硝酸盐已完全还原成亚硝酸盐，亚硝
酸盐又被分解成了氨和氮，如变为橙色，表明菌株不能还原硝酸盐。
检查乳糖-明胶培养基,如发现产气和培养基由红色变为黄色, 表明乳糖发酵并产酸。
将试管置5℃冷却1h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，需36±1℃再培养24 h，重
复检查明胶是否液化。用产芽孢肉汤涂片作革兰氏染色，在显微镜下检查有无芽孢。如需
对分离物作进一步检查，应将芽孢培养物于4℃存放。
无动力、革兰氏阳性，在TSC琼脂平板上产生黑色菌落，还原硝酸盐为亚硝酸盐，乳
糖发酵产酸产气，在48 h内液化明胶的杆菌，可初步认为是产气荚膜梭菌。可疑为产气荚
膜梭菌而又不符合上述特征的，必须做进一步证实试验。对不液化明胶或在其他方面不典
型的分离物要接种液体硫乙醇酸盐培养基，36±1℃培养24h，进行涂片，作革兰氏染色，
检查培养物的纯度，以0.1 mL液体硫乙醇酸盐培养物，接种到含1％水杨甙和含1％棉子糖
的PY培养基各1 管，观察产酸和产气，取1.0 mL培养物放于试管中，加1～2滴0.04％酚红
溶液，检查是否产酸(大多数产气荚膜梭菌，不发酵水杨甙，但同它密切相关的梭状芽孢
菌，能迅速发酵水杨甙产酸产气)。再将此两种培养基培养48h，观察产酸情况。产气荚膜
梭菌通常在含棉子糖的培养基中产酸，而同其密切相关的其他梭状芽孢菌却不能在含棉子
糖的培养基中产酸。有少数产气荚膜梭菌菌株，在含水杨甙的PY培养基中产酸。
6 结果解释及报告
样品中产气荚膜梭菌的计数, 基于被证实为产气荚膜梭菌菌落的百分数(例如,10**-4
稀释的平板中，平均有85个菌落，10个菌落中，有8 个被证实为产气荚膜梭菌，那么每克
食品中产气荚膜梭菌数，即为85×(8/10)×10000＝680000)，报告产气荚膜梭状芽孢杆菌
数/g(mL)。
注：用含卵黄的TSC平板计数时的稀释倍数比用不含卵黄的平板计数时的稀释倍数高
10倍。

附　录 A
培养基和试剂的配制
(补充件)

A1　胰(月示)-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂
胰(月示) 15.0g
大豆胨 　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
酵母膏　　　　　　　　　　　　　　　　 5.0g
偏亚硫酸氢钠[sodium bisulfite(meta)] 1.0g
柠檬酸铁铵　　　　　　　　　　　　　　 1.0g
琼脂 20.0g
加蒸馏水稀释到1000mL，调至pH7.6±0.1，分装到500mL烧瓶中，每瓶250mL。121℃
高压灭菌15min，倒平皿前，每250mL培养基(50℃)中，加过滤除菌的0.5％ D-环丝氨酸溶
液20.0mL。
制作卵黄平板：加50％卵黄乳液20 mL到250 mL含D-环丝氨酸培养基中，倾注到无
菌平皿中，每皿约15mL。使用前应将平皿置室温使其干燥。
A2　D-环丝氨酸溶液
溶解1gD-环丝氨酸于200 mL磷酸盐缓冲液(c＝0.05mol/L)(pH8.0±0.1)中(不加热)，
经0.45μm滤膜过滤除菌。
A3　卵黄乳液
用硬刷刷洗鲜蛋，沥干，放70％乙醇中浸泡1h。以无菌操作取出蛋黄，加等体积无菌
0.8％氯化钠溶液，混合置4℃贮存。
A4　缓冲动力-硝酸盐培养基
牛肉膏　　　　　　　　　　　　　　　　3.0g
蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
硝酸钾　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4) 　　 2.5g
半乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
甘油　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
琼脂 3.0g
用蒸馏水溶解并稀释到1000mL。调至pH7.3±0.1，分装试管，每管11mL。121℃高压
灭菌15min。
A5　乳糖-明胶培养基
胰(月示)　　　　　　　　　　　　　 　15.0g
酵母膏 10.0g
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　 10.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4)　　 5.0g
酚红　　　　　　　　　　　　　　　　 0.05g
明胶 120.0g
用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，调至pH7.5±0.1，加入乳糖和酚红。分装试管，每管
10 mL。121℃高压灭菌15min。
A6　产芽孢肉汤
多价胨(polypeptone) 15.0g
酵母膏　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.0g
可溶性淀粉　　　　　　　　　　　　　　　 3.0g
硫酸镁 0.1g
硫乙醇酸钠　　　　　　　　　　　　　　　 1.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4) 11.0g
用蒸馏水溶解稀释到1000mL，调至pH7.8±0.1，分装试管，每管15 mL。121℃高压灭
菌15min。
A7　多价蛋白胨-酵母膏(PY)培养基
多价胨 20.0g
酵母膏　　　　　　　　　　　　　　　　　 5.0g
氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　 5.0g
用蒸馏水溶解并稀释到1000mL, 调至pH6.9±0.1, 分装到带螺帽的试管内,每管9mL。
121℃高压灭菌15 min。
A8　硫乙醇酸盐液体培养基
胰酪胨 15.0g
L-胱氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　 0.5g
氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　 2.5g
葡萄糖　　　　　　　　　　　　　　　　　 5.0g
酵母膏　　　　　　　　　　　　　　　　　 5.0g
硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸)　　　　　　　　　 0.5g
刃天青钠溶液(1:1000)(新鲜配制)　　　　　 1 mL
琼脂 0.75g
将胱氨酸、氯化钠、葡萄糖、酵母膏和胰胨同1000mL蒸馏水混合，并在阿诺氏消毒器
或蒸气浴中加热，直至完全溶解，并加入硫乙醇酸钠或硫乙醇酸溶液，使溶解。如必要可
用1mol/L氢氧化钠调整pH，使消毒后的pH在7.1±0.2，加刃天青钠溶液，混合，将培养基
分装到150mm×16mm螺旋盖试管内，每管10mL，121℃高压灭菌20min。
A9　蛋白胨水
在2000 mL蒸馏水中溶解蛋白胨2.0g，调至pH7.0±0.1。在200 mL瓶中分装90 mL，在
500 mL锥形瓶中分装225 mL。121℃高压灭菌15min。
A10 亚硝酸盐试剂
a．　试剂甲
在1000mL 5mol/L乙酸中溶解对氨基苯磺酸8g；
b. 试剂乙
在1000mL 5mol/L乙酸中溶解α-萘酚5g。
A11 缓冲甘油-氯化钠溶液
在900mL蒸馏水中溶解氯化钠4.2g，加无水磷酸氢二钾12.4g，无水磷酸二氢钾4.0g和
甘油100mL，混合，充分溶解。调至pH7.2。121℃高压灭菌15min。
配制双料缓冲甘油溶液(20％)时，用甘油200mL和蒸馏水800mL。

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附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由上海进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人吴仲梁。
本标准参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版，第46章，第46、092节
(1994年)。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施