中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准

出口食品沙门氏菌属 SN 0171?92
(包括亚利桑那菌)的荧光抗体筛选检验方法 代替ZB C53 007-85

Fluorescent antibody screening method of Salmonellae
(including Arizona) in food for export
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1 主题内容与适用范围
本标准规定了冻猪肉、冻鸡肉鸡蛋黄粉和冰鸡蛋白中沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)
检验方法。
本标准适用于冻猪肉、冻鸡肉鸡蛋黄粉和冰鸡蛋白中沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)
检验,其他类食品可参照使用。
2　引用标准
SN 0170 出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法
3　设备与材料
见SN 0170,另附加以下特殊项目。
3.1　载玻片：76mm×26mm,厚度0.8～1.0mm,事先刻好编号及8个小方格,自左至右每行
4格,上下共2行(或采用供免疫荧光技术专用的多凹涂膜载玻片),用洗涤剂彻底洗净油污,
擦洗干净,并经滴水检查证实无油污后,再浸于95％乙醇中保存备用。
3.2　盖玻片：22mm×22mm,厚度0.13～0.17mm,按同上方法进行去除油污处理。
3.3　荧光显微镜：具有透射光或落射光光源装置,配装能透射波长为330～500nm的激发
滤片与接收波长大于400nm的阻断滤片。
4　溶液与试剂
4.1　0.01mol/L pH9.0磷酸盐-生理盐水缓冲溶液(PBS)
溶解无水磷酸氢二钠1.42g,氯化钠8.5g于1000 mL蒸馏水中,使完全溶解,用酸度计
测定其pH值至9.0以上即可,必要时可用1mol/L氢氧化钠调整至pH9.1左右。
4.2　固定液
按顺序将无水乙醇60mL、三氯甲烷(CHCl3) 30mL混匀,再加入36％～38％甲醛10mL,
混匀即成。
注：此项固定液配制后可置4℃贮存,但重复使用次数以不超过3次为宜。
4.3 pH9.0碳酸盐-甘油缓冲溶液
溶解无水碳酸钠6g,无水碳酸氢钠37g于蒸馏水中,加至1000mL,使完全溶解,混匀,
即成pH9.2碳酸盐缓冲液。
以上项缓冲液1份加甘油9份混匀即或。
注：①所用甘油应选用优级纯品或分析纯品。
②配成后置4℃贮存,在贮存期间其pH值逐渐下降,应以每2周左右重新配制一次
为宜。
4.4　沙门氏菌多价荧光抗体试剂
选用经国家进出口商品检验局指定的以FITC标记的沙门氏菌A-67全价“OH”免疫球蛋
白(或沙门氏菌A-60多价“OH”免疫球蛋白),染色时应按试剂所标明的常规染色工作浓度
和稀释方法进行稀释后使用。
注：①所用荧光抗体试剂应在有效期限以内。
②已稀释的荧光抗体试剂置4℃贮存可使用1个月左右,保持其固有的染色亮度不
变,如发现其染色亮度下降,则不能继续使用。
5　试样制备
参照SN 0170第2章进行。
6　增菌培养
参照SN 0170第2章进行。
7　染色
7.1　以直径3mm的接种环取已接种试样的最后增菌培养液1环,制成较薄的标本涂片,置
37℃恒温箱(或室温)充分晾干后,用无水乙醇-三氯甲烷-甲醛固定液固定5～10min,再用
95％乙醇浸洗后晾干(此项乙醇重复使用以不超过3次为宜)。
7.2　将沙门氏菌A-67多价“OH”免疫球蛋白试剂(或A-60多价“OH”免疫球蛋白试剂)
按染色工作浓度滴加于各标本涂片上,放湿盒内,置37℃经30 min后取出,用0.01 mol/L
pH9.0PBS冲去多余的荧光抗体,另换相同PBS浸洗10min,再以蒸馏水冲洗后晾干。
7.3　滴加pH9.0碳酸盐-甘油缓冲溶液后,加盖玻片封片。
注：①对所用荧光抗体之染色工作浓度,必要时可用已知标准菌种重新测定。
②每次涂片检查时皆应挑用1至数个已知染色阳性菌种作为对照实验。
8　镜检及报告结果
8.1　镜检
先用低倍物镜扫视整个标本,再换较高倍物镜进行观察,并记录染色亮度与菌量等情
况。
菌体荧光染色亮度评定标准如下。　
4＋: 黄绿色闪亮荧光,菌体周围及中心轮廓清晰。
3＋: 黄绿色明亮荧光,菌体周围及中心轮廓清晰。
2＋: 黄绿色荧光较弱,菌体周围及中心轮廓清晰。
1＋: 仅有暗淡的荧光,菌形尚可见。
?: 无荧光或菌形不清。
8.2　结果判定
应结合发荧光菌体的形态、荧光亮度与菌量综合判定。
8.2.1　阳性及可疑阳性结果：菌体之荧光亮度达到2＋左右,菌体形态特征基本符合沙
门氏菌,且多数视野中均能检出数个菌体以上。
8.2.2　阴性结果：荧光亮度在2＋以下,且不属于可疑阳性范围者,均为阴性。
8.3　报告方法
8.3.1　荧光染色镜检为阴性结果：报告为“未检出沙门氏菌”或“未检出亚利桑那菌”
或“未检出沙门氏菌和亚利桑那菌”。
8.3.2　荧光染色镜检为阳性或可疑阳性结果,按SN 0170第3章继续进行培养法检查,并
根据培养法检查结果作报告。

附　录 A
出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)
荧光抗体筛选检验方法示意图
(参考件)
肉类 蛋品类
┌────┴────┐ ┌───┴────┐
↓ ↓ ↓ ↓ 
┌───────┐ ┌───────┐ ┌──────┐ 　┌──────┐
│　前增菌法 　│ │ 直接增菌法 │ │ 干蛋品 │ │ 冰蛋品 │
└───┬───┘ └───┬───┘ └───┬──┘ 　└───┬──┘
↓ ↓ ↓ ↓ 
┌───────┐ ┌───────┐　　┌──────┐　 ┌──────┐
│ 25g样品加25mL│ │25g样品加25mL │ │　前增菌法 │ │ 直接增菌法 │
│ BP,打碎 │ │ SC,打碎 │ └───┬──┘ └───┬──┘
└───┬───┘ └───┬───┘ ↓ ↓
↓ 移入 ↓ 移入 　　 ┌──────┐ 　┌──────┐
┌───────┐　 ┌───────┐ │ 25g样品 │ 　│　　25g样品 │
│ 20mL BP │ │ 200mL SC │ │ 加225mL │ │ 加225mL │
└───┬───┘ └───┬───┘ │ BP,摇匀 │ │TTB或SC,摇匀│
↓ │ └───┬──┘ └───┬──┘
┌───────┐ │ ↓ │
│10mL转种100mL │ │ ┌───────┐ │
│ TTB或SC │ │ │10mL转种100mL │ │
└───┬───┘ │ │ TTB或SC │ │
│ │ └───┬───┘ │
│ ↓ ↓ │
└───────────────┬──────────────┘
↓
┌───────┐
│ 涂片、固定 │
└───┬───┘
↓
┌───────┐
│ 染　　色 │
└───┬───┘
↓
┌───────┐
│ 镜　　检 │
└───┬───┘
↓
┌────────────┐
↓ ↓
┌────────┐　　　　┌──────┐
│阳性及可疑阳性 │ │ 阴　　性 │
└────────┘ └──┬───┘
↓ │
┌────────┐ │
│ 纯分离培养 │ │
└────────┘ │
↓ │
┌────────┐ │
│ 生化学试验 │ │
└────────┘ │
↓ │
┌────────┐ │
│ 血清学试验 │ │
└───┬────┘ │
│　　┌──────┐ 　│
└─→│ 报告结果 │←─┘
└──────┘
注:①以上各项增菌培养温度时间和分离方法,生化学及血清学试验,均参照SN 0170
进行。
②对可疑阳性结果可根据需要用原增菌培养液重新涂片、染色、镜检复查一次。

附　录 B　
直接法免疫荧光染色步骤示意图
(参考件)
┌──────────────────┐
│ 标本(增菌液)涂片(用直径3mm接种环) │
└─────────┬────────┘
↓　－－－－－－－－－－－－晾干
┌──────────────┐
│ K氏固定液固定(5～10min) │
└──────┬───────┘
↓
┌──────────────┐
│ 95％乙醇(浸洗)* │
└──────┬───────┘
↓　－－－－－－－－晾干
┌──────────────┐
│　加荧光抗体(适宜工作浓度) │
└──────┬───────┘
↓　( 放湿盒内37℃30min)
┌──────────────┐
│ 0.01mol/L pH9.0 PBS(冲洗) │
└──────┬───────┘
↓
┌──────────────┐
│ 换同上PBS(浸洗10min或振荡)│
└──────┬───────┘
↓　－－－－－－－－晾干
┌──────────────┐
│ 　　 蒸馏水(冲洗) │
└──────┬───────┘
↓
┌─────────────────┐
│ 　加pH9.0碳酸盐-甘油缓冲溶液封片 │
└─────────────────┘
* 暂按每浸洗3次左右换乙醇溶液1次。

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附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局起草。
本标准主要起草人何镜承、戚玉凤、张凤才。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施