中华人民共和国专业标准 中华人民共和国专业标准

蛋 白 酶 活 力 测 定 法 ZB X 66030-87

Measurement of proteinase activity
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1 福林法
1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯
1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4?2H2O)
100g,钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,
以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再
煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶
液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。
1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。
1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。
1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)31.2g,定容至1000mL,即
成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成
0.2mol溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在
水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即
成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐
步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10
mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使
用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。
1.2 仪器
a. 分析天平: 感量0.1mg;
b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计;
c. 水浴锅;
d. 1、2、5、10mL移液管等。
1.3 操作
1.3.1 标准曲线的绘制
1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。
表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━
┃ 管 号 
试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━
┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 
━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
蒸馏水,mL ┃10 ┃ 8 ┃ 6 ┃ 4 ┃ 2 ┃ 0
100μg/mL酪氨酸,mL ┃ 0 ┃ 2 ┃ 4 ┃ 6 ┃ 8 ┃ 10
酪氨酸最终浓度,μg/ml ┃ 0 ┃ 20 ┃ 40 ┃ 60 ┃ 80 ┃ 100
━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━
1.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol
碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min在
581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行
测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(
蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。
为了清楚起见。再列出表格如下 (表2)。
表 2
━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━
┃ 管 号
试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ 
┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 
━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 
━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
0.4mol/L Na2CO3,mL ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5
━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
福林试剂,mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1
━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃ 1 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃ 2 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
O D值 ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃ 3 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃ 平均 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
净O D值 ┃ 0 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━
以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相
当的酪氨酸量K)。
1.3.2 样品稀释液的制备。
1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此
液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。
1.3.2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌
1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。
1.3.3 样品测定: 取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品
稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,
时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使
残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤
液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min后进行光
密度(OD)测定。
空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加
0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。
为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表3及表4)。
表 3
━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━
┃ 管 号 ┃ 试 剂 ┃ 管 号
试 剂 ┣━┳━┳━┫ ┣━━┳━━┳━━
┃1 ┃2 ┃3 ┃ ┃(1) ┃(2) ┃(3)
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━
预热酶液, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃预热酶液, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━
预热2%酪蛋白, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃0.4mol三氯乙酸, mL ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2
━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━
作用10min (精确计时) ┃作用10min (精确计时)┃ ┃
━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━
0.4mol三氯乙酸, mL ┃2 ┃2 ┃2 ┃预热2%酪蛋白, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1
━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━
表 4
━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━
┃ 管 号
试 剂 ┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━
┃1 ┃ 2┃ 3 ┃(1) ┃(2) ┃ (3) 
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
滤 液, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
0.4mol Na2CO3,mL ┃5 ┃ 5┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
福林试剂, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
O D值 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━
平均O D值 ┃ ┃
━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
净O D值 ┃ ┃ 0
━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。
1.4 计算
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
A 1
样品蛋白酶活力单位(干基)=━━×4×N×━━━ ……………………… (1)
10 1 - W
式中:A??由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K);
4??4毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍);
N??酶液稀释的倍数;
10??反应10min;
W??样品水分百分含量。
1.5 注意事项
以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,
则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH
缓冲液配方提供如下:
1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L)
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO4?2H2O)0.5g以蒸
馏水溶解定容至1000mL。
1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol)
A 液: 称取80%～90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。
B 液: 称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。
取A 液16mL与B 液1mL混合稀释一倍即成。
1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol)
A 液: 称取80%～90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。
B 液: 称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。
取A 液8mL与B 液1mL,混合稀释一倍即成。
1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液
A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.05mol)。
B 液: 称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.2N)。
取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。
1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液
A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL 。
B 液: 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL 。
取A 液与B 液等量混合。
1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。

2 甲醛法
成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。
2.1 仪器
a. 分析天平:感量0.01g;
b. 水浴锅;
c. 电烘箱;
d. 容量瓶、吸管、滴定管等。
2.2 试剂与溶液
a. 1%酚酞指示剂;
b. 0.1%麝香草酚蓝;
c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛(试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZB X 66038?87《氨
基态氮测定法》)。
2.3 操作
2.3.1 目测法
称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55℃温水80mL,充分摇匀,置于
55℃水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以
脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N
氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH 8.2),记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用
0.1N氢氧化钠液滴定至深红色(pH 8.5)为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫
红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。另称取曲10g做水分,再折算成
干基数。
2.3.2 酸度计法
所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同 (见 ZB X 66038-87)。
2.4 计算
蛋白酶活力 (克氨基态氮/100g)(干基)
(V-***Vo)×N×0.014 100
=━━━━━━━━━━×━━━ ……………………………… (2)
10 1 -W
10×━━━
100
式中:V??加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL;
***Vo??甲醛空白滴定数, mL;
W??曲水分,%;
N??氢氧化钠标准溶液的当量数,N;
0.014??氮的毫克当量数。

━━━━━━━━━

附加说明:
本标准由商业部副食品局提出。
本标准由上海市酿造科学研究所起草。
本标准主要起草人须凤高。

━━━━━━━━━
*本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋
白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。在培养和堆放过程,
环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。为了能和福林法的酶活力进行对照,
可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步
骤完全相同。杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液
煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
中华人民共和国商业部1987-11-20批准 1988-07-01实施?