中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准

出口鳗鱼中吡咯嘧啶酸残留量 SN 0335?95
检 验 方 法
Method for the determination of piromidic acid
residues in eel for export
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1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口鳗鱼中吡咯嘧啶酸残留量检验的抽样、制样和液相色谱测定方法。
本标准适用于出口鳗鱼(活鳗和烤鳗)中吡咯嘧啶酸残留量的检验。 
2 抽样和制样 
2.1 检验批
烤鳗以不超过 2 000件为一检验批。
活鳗以同一养鳗池同一规格为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同的特征,如包装、标记、产地(养鳗场)、规格和等级等。
2.2 抽样数量
2.2.1 烤鳗
批量,件 最低抽样数,件
1～ 1 000 4
1 001～ 2 000 6
2.2.2 活鳗
每一检验批抽取活鳗两条。
2.3 抽样方法
2.3.1 烤鳗
按 2.2.1规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少抽取一条作原始样品,原始
样品总量不少于 1 kg,放入洁净容器内,加封后标明标记,及时送交实验室。
2.3.2 活鳗
按 2.2.2规定的抽样数量随机抽取,标明标记,及时送交实验室。 
2.4 试样制备
从每条原始烤鳗样品中取出部分代表性样品(每条活鳗样品将其窒息,开膛去除内脏后
切碎),放入组织捣碎机中捣碎,充分混匀后按四分法缩分出不少于 200 g试样,装入洁净
的容器内,加封,并标明标记。
2.5 试样保存
将试样于 -18℃以下冷冻保存。
注：在抽样及制样的操作过程中,必需防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3 测定方法

3.1 方法提要
用三氯甲烷－甲醇提取试样中的吡咯嘧啶酸,于提取液中加入缓冲溶液进行液液分配。
蒸干三氯甲烷层,残渣用乙腈、正己烷溶解后,用氯化钠水溶液进行液液分配,水相用
二氯甲烷提取,蒸干二氯甲烷层,其残留物用甲醇－水－乙腈溶解,供 HPLC测定,外标
法定量。
3.2 试剂和材料
除另有规定外,试剂均为分析纯。水指蒸留水。
3.2.1 乙腈：色谱试剂(液相色谱专用)。
3.2.2 甲醇：色谱试剂(液相色谱专用)。
3.2.3 三氯甲烷：经重蒸馏。
3.2.4 二氯甲烷：经重蒸馏。
3.2.5 正己烷：经重蒸馏。
3.2.6 氯化钠。 
3.2.7 柠檬酸。
3.2.8 氢氧化钠。
3.2.9 硼酸。
3.2.10 无水硫酸钠：640℃ 灼烧4 h,贮于干燥器内备用。 
3.2.11 十二烷基磺酸钠。
3.2.12 磷酸氢二钠。
3.2.13 缓冲溶液(pH 3)：将0.1mol/L柠檬酸158.9mL和0.2mol/L磷酸氢二钠41.1 mL混
合配制。
3.2.14 硼酸缓冲溶液(pH 10.0)：取硼酸 6.183 g 溶于约600 mL水中,用 1 mol/L 
氢氧化钠溶液调整pH 为10.0 后加水定容至1L。
3.2.15 吡咯嘧啶酸标准品：纯度 ≥99％。
3.2.16 吡咯嘧啶酸标准液：准确称取吡咯嘧啶酸 10.0 mg,溶于 100 mL硼酸缓冲液
( pH 10.0)中配成 0.100 mg/L 的储备液。根据需要用甲醇－水－乙腈( 4＋5＋2)
稀释配制成适当浓度的标准工作液。
3.3 仪器和设备
3.3.1 高速均质器：3 000 r/min。
3.3.2 离心机：3 000 r/min。
3.3.3 振荡器。
3.3.4 旋转蒸发器。
3.3.5 液相色谱仪配有紫外检测器。
3.3.6 微量注射器：100 μL。
3.4 测定步骤
3.4.1 提取和净化
称取试样 5.0g(精确至 0.1g),置于均质器中,加入无水硫酸钠 10 g 及三氯甲烷
－甲醇 (2＋1) 混合液 100mL ,均质 1 min, 3 000 r/min 离心10 min后,将提取液转入
500 mL 分液漏斗中。于残留物中再加三氯甲烷－甲醇(2＋1) 混合液 75 mL ,同样操作。
合并提取液。加入缓冲液 (pH 3)50mL ,振摇 5 min 。静置分层,取下层。于上层中加入
三氯甲烷 40 mL ,同样操作。合并下层溶液。用旋转蒸发器浓缩至干。将残留物用乙腈
10 mL 及正己烷50 mL移入预先加入 2％ 氯化钠溶液100 mL 的500 mL 的分液漏斗中,振
摇10 min,静置分层,取下层置于另一分液漏斗中。于上层中再加入乙腈 10mL ,振摇
5 min后,静置分层。合并下层溶液,再振摇5 min,静置分层,弃去上层溶液。于下层溶
液中加入二氯甲烷 50 mL,振摇 10 min。静置分层,取下层二氯甲烷。上层再用二氯甲烷
50 mL作同样操作。合并二氯甲烷层并使其全部通过装有 5 g 无水硫酸钠柱,滤入蒸馏
瓶中,用旋转蒸发器将二氯甲烷层浓缩至干。加入甲醇－水－乙腈(4＋5＋2)1.0 mL以溶
解残留物,供测定。
3.4.2 测定
3.4.2.1 色谱条件
a. 色谱柱:250 mm × 3.9 mm (内径),μ Bondapak C18 10μm 粒度；
b. 流动相：甲醇－柠檬酸 (0.1 mol/L)－乙腈 (4＋5＋2) (含0.025％十二烷
基磺酸钠)； 
c. 流速：1 mL/min；
d. 检定波长： 280 nm。
3.4.2.2 色谱测定
分别将等体积标准工作液、样液注入液相色谱仪,测量峰面积(或峰高)。
吡咯嘧啶酸响应值应在仪器测定线性范围内。吡咯嘧啶酸保留时间约 10 min。
3.4.3 空白试验
除不称取样品外,按上述测定步骤进行。
3.5 结果计算和表述
按下式计算试样中吡咯嘧啶酸的含量：

A?c?V
X=━━━━━━
As?M
式中：X??试样中吡咯嘧啶酸含量,mg/kg；
A??样液中吡咯嘧啶酸色谱峰面积(或峰高),mm**2(或 mm)；
As??标准工作溶液中吡咯嘧啶酸色谱峰面积(或峰高), mm**2(或 mm)；
c??标准工作溶液中吡咯嘧啶酸的浓度,μg/mL；
V??样液最后定容体积,mL；
m??试样量,g。
注：计算结果需扣除空白值。
4 测定低限、回收率
4.1 测定低限
本方法测定低限为 0.05 mg/kg。
4.2 回收率
回收率的实验数据：吡咯嘧啶酸添加浓度在 0.05～0.4 mg/kg 范围内,回收率为
76.7％～89.7％。
注：考虑到柠檬酸对色谱柱的使用寿命有影响,也可用0.5 mol/L的 H3PO4 溶液
调节pH到4的甲醇－水－乙腈(25＋55＋20)作流动相。

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附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国福建进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人梁鸣、林碧贞。
参考文献：
日本厚生省环境卫生局“家畜及水产食品中残留量检验方法”第二册,日本(1982
年3月)。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1995-05-29批准 1995-11-01实施