中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准

出口禽肉中莫能菌素残留量检验方法
生物自显影法 SN 0296一93
Method for the determination of monensin
residues in poultry meat for export
?Bioautography method
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1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口禽肉中莫能菌素残留量的抽样、制样和生物自显影测定法。
本标准适用于出口冻鸡中莫能菌素残留量的检验。
2　抽样和制样
2.1　检验批
以不超过2500件商品为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
2.2　抽样数量
批量,件　　　　　　　　　　　　最低抽样数,件
1～25　　　　　　　　 　　　　　　　　1
26～100　　　　　　　　　　　　　　　　5
101～250 10
251～500 15
501～1000　　　　　　　　　　　　　　　17
1001～2500　　　　　　　　　　　　　　　20
2.3　抽样方法
按2.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,原始样
品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后标明标记,及时送交实验室。
2.4　样品制备
从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎均
匀,充分混匀,用四分法缩分出不少于1kg试样。装入清洁容器内,加封后标明标记。
2.5　样品保存
将试样于?18℃冷冻保存。
注：在抽样及制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3　测定方法
3.1　方法提要
用甲醇提取肉样中莫能菌素,经四氯化碳萃取后浓缩至干,以甲醇溶解残留物,用薄
层分离,再用生物自显影法测定。
3.2　设备和材料
3.2.1　微量注射器：50 μL。
3.2.2　薄层板：硅胶,Q/YT 257?85SG,5cm×20cm,使用前110℃活化2h。
3.2.3　展开缸：240mm×57mm×32mm。
3.2.4　游标卡尺：测量范围0～200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈测量仪测量。
3.2.5　离心机：转速3000 r/min。
3.2.6　旋转浓缩器。
3.2.7　恒温培养箱：37±1℃。
3.2.8　高压灭菌器。
3.2.9　长方形培养皿：20cm×10cm×5cm。
3.2.10 均质器：带均质杯250mL。
3.3　试剂和培养基
3.3.1　试剂
3.3.1.1　甲醇：分析纯。
3.3.1.2　四氯化碳：分析纯。
3.3.1.3 乙酸乙酯: 分析纯。
3.3.1.4　莫能菌素标准品: 960μg(效价)/mg(中国兽药监察所提供)。
3.3.1.5　试验菌种：枯草杆菌(Bacillus subtilis), 菌种号ATCC 6633(卫生部药品生物
制品检定所提供)。
3.3.2　培养基
3.3.2.1　菌种用培养基(见附录A 第A1章)。
3.3.2.2　生物自显影用培养基(见附录A第A2章)。
3.3.2.3　肉汤培养基(见附录A第A3章)。
3.4　测定步骤
3.4.1 工作液制备
3.4.1.1　莫能菌素标准贮备液
准确称取适量的莫能菌素标准品,用甲醇溶解配制成浓度为500μg(效价)/mL的莫能
菌素标准溶液。配制后于冰箱中保存,一周内使用。
3.4.1.2　莫能菌素标准工作液
吸取标准贮备液,用甲醇分别稀释成2,3,4,5,10和15μg(效价)/mL的标准工作
标准液。以上稀释液均须当日配制。
3.4.1.3　菌种培养及芽胞菌悬浮液制备
将菌种安瓿瓶的上部消毒后敲碎,加入少量肉汤培养基,使其溶解并移至肉汤管中混
匀。置37±1℃温箱中培养24h。将培养物接种于菌种培养基中,置于37±1℃培养一周,
镜检含芽胞菌数达85%以上, 便可制备芽胞悬浮液。
用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔,然后将该菌液转移至离心管中,充分摇匀后,于3000
r /min离心30min, 弃去上清液,再加入同样量的灭菌生理盐水重复离心一次。弃去上清
液,再加入适量灭菌生理盐水,摇匀后于65℃水浴中加热30min,然后,于1000 r/min离
心5min, 取上清液并转入灭菌试管中,即为芽胞菌悬浮液,置于冰箱中保存,可使用一个
月。
3.4.2　试液制备：准确称取绞碎试样10g(精确至0.1g)于均质杯中,加入20mL甲醇,均质
2min后,移入离心管中,于3000 r/min离心20min。取其上清液15mL,转入盛有5mL蒸馏水
的250mL分液漏斗中,混合后加入10 mL四氯化碳,充分振摇,静置分层,放出四氯化碳层
于150 mL茄形瓶中。用四氯化碳再重复提取两次, 合并四氯化碳至上述茄形瓶中, 于50～
60℃水浴中用旋转蒸发器浓缩至干,加入0.5mL甲醇溶解残留物供TLC实验用。此样液中相
当于禽肉试样浓度为15g/mL。
3.4.3　测定
3.4.3.1 生物自显影
将每个样品及标准溶液分别点在四块薄层板上,先于每块薄层板下端2cm处划一条基
线,然后在这条基线上分别点20μL试液和3μg(效价)/mL莫能菌素标准溶液,试液和标准
溶液点相距2.5cm。在展开缸中用乙酸乙酯进行展开,直至溶剂前沿线距板顶端1.5cm处为
止,取出薄层板,风干后备培养用。
将薄层板水平置于高压灭菌的长方形培养皿中,无菌操作将已熔化并冷却至50～55℃
的生物自显影用培养基均匀地喷在其表面上,然后用10mL上述接种芽胞菌悬液的培养基铺
满整个薄层板,保持水平,待其凝固,于37±1℃培养18 h。
3.4.3.2　对照试验
除不加试样外,按上述测定步骤进行。
3.5　结果计算和表述
经过培养后,在薄层板上与莫能菌素标准液产生抑菌圈的Rf值(约0.38)相同位置上,
显现抑菌圈者即为阳性。
当样品判定为阳性时,测量四块薄层板上的试液及标准溶液产生的抑菌圈直径,分别
计算出平均值。当每组四个直径值的相对标准偏差(RSD)均不超过5%时,并且试液的抑菌
圈直径与标准溶液(20μL)的抑菌圈直径近似(直径相差不超过±1mm),则其样品中莫能菌
素含量按下式计算：
c
X＝──
m
式中：X??样品中莫能菌素的含量,mg/kg；
c??试验中所用的标准溶液的浓度,μg/mL；
m??最终试液所代表的禽肉试样的浓度,g/mL。
4　测定低限、回收率
4.1　测定低限
本方法测定低限为0.20mg(效价)/kg。
4.2　回收率
回收率的实验数据:莫能菌素浓度在0.20～0.67mg(效价)/kg范围内,回收率为81%～
100%。

附　录 A　
培养基成分及制备方法
(补充件)
A1　菌种用培养基
蛋白胨 10.0g
牛肉浸膏 5.0g
氯化钠　　　　　　　　　 2.5g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其
灭菌后pH为6.5±0.1,分装于试管或克氏瓶内,于121℃ 15min高压灭菌,灭菌后制备成
所需斜面备用。
A2　生物自显影用培养基
蛋白胨 10.0g
酵母浸膏　　　　　　　　 2.5g
葡萄糖 10.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其
灭菌后pH为6.0±0.1,分装于锥形瓶内,于121℃15 min高压灭菌,备用。
A3　肉汤培养基
蛋白胨 10.0g
牛肉浸膏　　　　　　　　 5.0g
氯化钠　　　　　　　　　 2.5g
蒸馏水 1000mL
将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使
其灭菌后pH为7.0±0.1,分装于试管中,于121℃15min高压灭菌。

附 录 B　
检验程序图
(补充件)
试样(10.0g) 试验菌培养
┃ ┃
┃ 于均质杯内加入 ┃
┃ 20 mL甲醇 ┃
┃ ┃
均质2 min ┃
┃ 移入离心管 ┃
┃ ┃
离心20 min(3000r/min) 菌液制备
┃ ┃
取上清液(15 mL) ┃
┃ 转入盛有5mL蒸馏 生物自显影用培养基
┃ 水的分液漏斗中 ┃
┃ ┃
┃ ┃
加入四氯化碳(10 mL) ┃
┃ 充分振摇后分取四氯化碳层 ┃
┃ 转入茄形瓶中, 再重复两次 ┃
┃ ┃
合并入上述茄形瓶中 ┃
┃ ┃
蒸干 ┃
┃ ┃
用0.5mL甲醇溶解 ┃
┃ ┃ 
层析 ┃ 
┃ ┃ 
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┃
培养 
┃
┃
检定
┃
┃
结果和表述 

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附加说明:
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。
本标准等同采用日本厚生省检验方法：畜水产食品中の残留物质检查法(1990)。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-12-28批准 1994-05-01实施