WS/T 571—2017 裂头绦虫幼虫检测.pdf中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
WS/T 571—2017
裂头绦虫幼虫检测
Detection of diphyllobothroid larvae
2017 - 08 - 01 发布 2018 - 02 - 01 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布
前 言
本标准依据GB/T 1.1－2009给出的规则起草。
本标准起草单位： 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、上海出入境检验检疫局、上海市疾
病预防控制中心。
本标准起草人： 陈韶红、李树清、张小萍、许学年、卢艳、蔡玉春、张永年、李浩、艾琳、郑彬。
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裂头绦虫幼虫检测
1 范围
本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程。
本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检
测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18088 出入境动物检疫采样标准
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
裂头蚴 plerocercoid larvae
裂头绦虫的幼虫，是假叶目（ Pseudophyllidea） 、 裂头科（ Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼
虫的总称（ 参见附录A） 。
3.2
阔节裂头蚴 plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或 phyllobothrium latum
寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫。
3.3
曼氏裂头蚴 plerocercoid larvae of Spirometra mansoni
寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。
4 仪器器材
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4.1 生物显微镜。
4.2 体视显微镜。
4.3 PCR 扩增仪。
4.4 电泳仪。
4.5 凝胶成像系统。
4.6 超净工作台。
4.7 高速离心机。
4.8 解剖用手术器械。
5 试剂材料
5.1 试剂
胃蛋白酶消化液； Tris-乙酸电泳缓冲液（ TAE）；琼脂糖凝胶； 6×加样缓冲液； 100～2000 bp DNA
marker； 灭菌双蒸馏水(ddH2O)； 70%乙醇（配制见附录 B 的 B.1） 。
5.2 引物
扩增裂头蚴核糖体 DNA 转录间隔区（ ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素 C 氧化酶（ Cox1）引物序
列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（ 见附录 B 的 B.2）。
5.3 阳性对照
阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。
6 检测步骤
6.1 样品准备
6.1.1 样品种类： 海鱼、淡水鱼、蛙和蛇。
6.1.2 样品采集： 采样按照 GB/T 18088 执行。
6.2 样品检测
6.2.1 压片检查法
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用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条/只进行解剖。取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表
面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物
的组织用载玻片压片， 用生物显微镜镜检判定结果。
6.2.2 蛋白酶消化法
称取样品 250 g 并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液 1:5 的比例加入消化液， 37℃消化至无肉眼
可见的肉组织为止。消化后用 0.8mm×0.8mm（ 10 目）网筛过滤，滤液置于尖底量筒内，加水（用水参
照 GB/T 66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿， 用体视显微镜镜检判定结果。
6.2.3 核酸检测法
6.2.3.1 取样
在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用。 PCR 反应设立阳性对照，对照为裂头绦虫相应基因片
段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。无菌水作空白对照。
6.2.3.2 DNA 的提取 （见附录 B 的 B.3）
6.2.3.3 反应体系
总体积为 25 L, 模板 DNA 2 L，上下游引物（ 10 mol/L）各 0.5 L， dNTPs 2 L， MgCl2 2.5 L，
10×Buffer 2.5 L， Taq 酶 (5 U/µL) 0.2 L，补充 ddH2O 至 25 L。
6.2.3.4 PCR 反应程序
94℃预变性 3 min； 94℃变性 30 s， 55℃退火 30 s， 72℃延伸 1 min ， 35 个循环； 72℃延伸 7 min。
6.2.3.5 电泳
取 10 L 产物与 2 L 的 6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶中。在 1×TAE
缓冲液中， 3 V/cm～4 V/cm 电泳约 30 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。
6.3 结果判定
6.3.1 裂头属的裂头蚴判定
若从鱼体内检出的幼虫大小若长 2mm~20 mm，宽 2mm~3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各
有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成
虫相似的头节，可初步判定裂头属的裂头蚴（ 参见附录 C）。
6.3.2 迭宫属的裂头蚴形态判定
若从蛙或蛇体内检出的幼虫大小若长 0.5cm~80 cm，宽 0.3cm~1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫
体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的
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皱褶，可初步判定为迭宫属的裂头蚴（ 参见附录 C）。
6.3.3 核酸扩增结果判定
6.3.3.1 目的基因扩增片段出现条带而空白对照未出现条带，实验结果成立。
6.3.3.2 阔节裂头蚴特异引物扩增，出现 428 bp 的特征条带，初步判定该虫种为阔节裂头蚴。
6.3.3.3 曼氏裂头蚴特异引物扩增，出现 156 bp 的特征条带，初步判定该虫种为曼氏裂头蚴。
6.3.3.4 若要进一步对幼虫定种，需将引物扩增产物进行测序，将其序列与 GenBank 上序列进行比对
后定种。
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AA
附 录 A
（ 资料性附录）
病原学资料
裂头蚴（ plerocercoid）是假叶目（ Pseudophyllidea）、裂头科（ Diphyllobothriidae）绦虫的第三期幼
虫的总称。裂头科中的裂头属（ Dibothriocephalus） 又名双叶槽属（ Diphyllobothrium）及迭宫属
（ Spirometra）的裂头蚴可感染人体。
A.1 形态
A.1.1 裂头属的裂头蚴的形态
阔节裂头蚴长 2 mm~20 mm，宽 2mm~3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹
的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，
裂头蚴皮层表面覆盖微毛，长度约 1.5 µm。
A.1.2 迭宫属的裂头蚴形态
曼氏裂头蚴长 0.5cm~80 cm，宽 0.3cm~1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中
央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶。
A.2 生活史
阔节裂头绦虫成虫寄生在人以及犬、猫、猪等动物的小肠内。虫卵随宿主粪便排出后，在 15~25℃
的水中，经过 7d~15d 的发育，孵出钩球蚴。当钩球蚴被剑水蚤吞食后，在其血腔内经过 2 周~3 周的发
育成原尾蚴。当受感染的剑水蚤被小鱼或幼鱼吞食后，原尾蚴可在鱼的肌肉、性腺、卵内发育为裂头蚴，
裂头蚴并可随着鱼卵排出。当大鱼吞食含有裂头蚴的小鱼或鱼卵后，裂头蚴可侵入大鱼的肌肉组织内继
续生存， 直到终宿主食入带裂头蚴的鱼时，裂头蚴方能在其肠内经 5 周~6 周发育为成虫。成虫在终宿
主体内可活 5 年~13 年。可感染阔节裂头蚴的第二中间宿主有：白斑狗鱼（ Esox lucius）、江鳕 （ Lota lota）、
河鲈（ Perca fluviatilis）、 三刺鱼（ Gasterosteus aculeatus）、 樱花钩吻鲑（ oncorhynchus masou）、 鮻鱼（ Liza
haematocheila）、溪红点鲑 （ Salvelinus fontinalis） 、虹鳟鱼 （ oncorhynchus mykiss） 、雅罗鱼属鲤 （ Leuciscus
rutilus）、八目鳗（ Lampetra japonicum）等。
曼氏迭宫绦虫的成虫寄生在猫、犬及食肉野生动物为终宿主的小肠内，虫卵随宿主粪便排出体外，
在适宜温度下，经过 2 周~5 周发育孵出六钩蚴，被剑水蚤吞食后发育成原尾蚴，原尾蚴被蛙类吞食可
发育成裂头蚴，人吞食含有裂头蚴的第二中间宿主可引起曼氏裂头蚴病。可感染曼氏裂头蚴的第二中间
宿主为蛙类；鸟类、蛇类、猪可作为转续宿主。
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BB
附 录 B
（规范性附录）
与检测相关的技术方法
B.1 试剂配制
B.1.1 胃蛋白酶消化液
胃蛋白酶2 g，浓盐酸0.7 mL，加蒸馏水至100 mL，现用现配。
B.1.2 Tris-乙酸电泳缓冲液（ TAE）
三羟甲基氨基甲烷（ Tris碱） 242 g， 冰乙酸57.1 mL， pH 8.0的 0.5 mol/L EDTA液100 mL， 加
蒸馏水定容至1000 mL， 制成50×TAE缓冲液，混匀4℃保存备用。临用前50倍稀释。
B.1.3 1×TAE使用液
50× TAE 20 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，混匀备用。
B.1.4 10 mg/mL溴化乙锭液
溴化乙锭1 g，加蒸馏水定容至100 mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。
B.1.5 1.5%琼脂糖凝胶
琼脂糖1.5 g，加1×TAE定容至100 mL，完全融化后，溶液冷却至60℃，加10 mg/mL 溴化乙锭5 µL
（终浓度0.5 µg/mL)，轻轻混匀后，制备凝胶。
B.1.6 6×加样缓冲液
溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g，加蒸馏水至100 mL。置4℃保存备用。
B.1.7 商品化试剂盒
Taq酶、 dNTP等核酸提取及PCR试剂可选用商品化试剂和试剂盒。
B.2 引物模板
裂头绦虫幼虫相关引物见表B.2
表B.2裂头绦虫幼虫相关引物
| 引物名称 | 引物编号 | 序列 | 片段大小/bp |
| 裂头蚴 ITS 通用引物 | 18S-DF1 | 5′-ACTTGATCATTTAGAGGAAGT-3′ | 1409 |
| 28S-DR4 | 5′-CTCCGCTTAGTGATATGCT-3′ | ||
| 裂头蚴 Cox1 通用引物 | JB6 | 5′-GATAGTAAGGGTGTTGA-3′ | 650 |
| JB5R | 5′-CAAGTATCRTGCAAAATATTATCAAG-3′ | ||
| 阔节裂头蚴特异引物 | Dl/Dn-1805F | 5′-CAGTGGGAATGGTGCTTGTAATGT-3′ | 428 |
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| Dl-2211R | 5′-TAACCTTTACTTATAACTACT-3′ | ||
| 曼氏裂头蚴特异性引物 | F965 | 5′-CTTGGCTTTATATGATTTAAATAG-3′ | 156 |
| R1120 | 5′-GTTTGGTGCACAGTACGTTTTAAAA-3′ |
B.3 DNA的提取
B.3.1 挑取单条待鉴定虫体放入灭菌离心管，加入灭菌蒸馏水，半小时换一次水，重复洗涤3次，洗涤
完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将离心管中虫体碾碎，加入180 µl Buffer ATL， 20 µl蛋白酶K，
混匀后于56℃孵育1~3 h至消化完全，期间不时振荡摇晃。
B.3.2 消化完全后，漩涡震荡15 s，加200 µl Buffer AL，立即漩涡振荡混匀，再加入200 µl 乙醇 (9
6～100%)，漩涡振荡混匀。
B.3.3 离心柱置于收集管上，将上一步的混合物吸入离心柱中， 8000 r/min离心 1 min，弃收集管。
B.3.4 将离心柱置于新的收集管中，加500 µl Buffer AW1， 8000 r/min离心 1 min，弃收集管。
B.3.5 将离心柱置于新的收集管中，加500 µl Buffer AW2， 14000 r/min离心 3 min，弃收集管。
B.3.6 将离心柱置于灭菌的1.5 ml离心管中，加入200 µl Buffer AE室温孵育1 min， 8000 r/min离心
1 min，离心所得DNA于-20℃冰箱保存备用（重复该步骤可扩大DNA回收率）。
B.4 实验试剂代码解释（试剂盒自带）
Buffer AL：裂解缓冲液（ Lysis buffer）
Buffer AW1：洗涤缓冲液1
Buffer AW2：洗涤缓冲液2
Buffer ATL ：组织溶解缓冲液
Buffer AE：溶解缓冲液
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CC
附 录 C
（资料性附录）
裂头蚴实物图
C.1 白鱼肌肉中的阔节裂头蚴见图C.1
图C.1
C.2 鳟鱼肌肉中的阔节裂头蚴见图C.2
图C.2
C.3 蛙体内的曼氏裂头蚴见图C.3
图C.3
C.4 蛇体的曼氏裂头蚴见图C.4
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图C.4
注： 图C.1来自参考自文献： Tomáš Scholz, Hector H. Garcia, Roman Kuchta, Barbara Wicht. updat on the Human
Broad Tapeworm (Genus Diphyllobothrium), Including Clinical Relevance.[J]Clin Microbiol Rev. 2009
January; 22(1): 146–160. doi: 10.1128/CMR.00033-08
图 C.2、 C.3、 C. 4 为检测样品自己拍摄.
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参 考 文 献
[1] 吴观陵. 人体寄生虫学. 第 4 版. 北京: 人民卫生出版社, 2013.
[2] Scholz T, Garcia HH, Kuchta R, Wicht B. updat on the human broad tapeworm (genus diphyllobothrium),
including clinical relevance. Clin Microbiol Rev. 2009, 22(1):146-160.
[3] 余森海, 许隆祺. 人体寄生虫学彩色图谱. 第 1 版. 北京: 中国科学技术出版社, 1992.
[4] 刘自逵, 刘国华, 戴荣四, 刘伟, 李芬, 等. 湖南省猬迭宫绦虫的线粒体 cox1 和 nad1 基因的序列测
定及种系发育分析. 畜牧兽医学报. 2010, 41: 463-468.
[5] Wicht B, Ruggeri-Bernardi N, Yanagida T, Nakao M, Peduzzi R, et al. Inter-and intra-specific
characterization of tapeworms of the genus Diphyllobothrium (Cestoda: Diphyllobothriidea) from
Switzerland, using nuclear and mitochondrial DNA targets. Parasitol Int. 2010, 59: 35-39.
[6] SH Chen, L Ai,YN Zhang, JX Chen, WZ Zhang, et al. Molecular Detection of Diphyllobothrium
nihonkaiense in Humans, China. Emerg Infect Dis, 2014,20:315–318.
_________________________________
关于发布《钉螺调查》等9项推荐性卫生行业标准的通告
国卫通〔2017〕11号
现发布《钉螺调查》等9项推荐性卫生行业标准，其编号和名称如下：
WS/T 563—2017 钉螺调查
WS/T 564—2017 巴贝虫病诊断
WS/T 565—2017 蛔虫病诊断
WS/T 566—2017 片形吸虫病诊断
WS/T 567—2017 阴道毛滴虫病诊断
WS/T 568—2017 阿米巴病肠外脓肿诊断
WS/T 569—2017 疟原虫检测 血涂片镜检法
WS/T 570—2017 肠道蠕虫检测 改良加藤厚涂片法
WS/T 571—2017 裂头绦虫幼虫检测
上述标准自2018年2月1日起施行。
特此通告。
国家卫生计生委
2017年8月1日
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